774.敌人的敌人就是朋友

    对59例egfr突变的晚期nsclc患者的肿瘤活检标本进行了检测，这些患者以前在1g/2gtki上经历过pd。在38例(63%)患者中检测到egfrt790m。1g/2gtki的中位ttp为10.3个月(范围为1.3-75.8个月)，t790m?组和t790m 组分别为7.4月和13.6个月(hr，1.64;95%ci，0.95-2.83;p=0.07;补充图s5)。在t790m 和t790m?组之间，之前接受治疗的情况没有差异，包括作为最后线治疗的egfrtki(65.8%vs.61.9%，p=0.76)、以前使用过化疗(76%vs.66%，p=0.75，wilcoxon检验)，或化疗暴露的持续时间(平均215天vs.175天，p=0.75)。与以前的报告一致，显微镜下的组织学转化是罕见的，一例鳞状转化(a450)和另一例混合腺癌小细胞组织学(a092)在基线和耐药后都观察到了。

    t790m 和t790m?疾病状态的基因组图谱

    我们首先评估了我们队列中的体细胞基因组改变（除egfrt790m外）与38例晚期egfr突变非小细胞肺癌患者的治疗初期队列（wes数据）的患病率差异。tp53snv改变在tki耐药人群（63%）中比治疗初期人群（45%）更为普遍。此外，我们检测到与治疗初期肿瘤相比，治疗耐药肿瘤中tert和编码于14q22的三个基因（ptgdr、sav1和sos2）的基因组扩增率总体较低。接下来，通过比较t790m 和t790m?，我们试图确定先前报道的并确定潜在的新的治疗可处理耐药机制?抗tki的样品。5例（8%）患者出现met改变，主要发生在t790m?患者队列。在一名患者（a056）中，检测到导致met外显子14跳跃（metex14）的剪接位点缺失，外显子14处的转录缺失通过rnaseq数据验证。该患者还表现出染色体臂7p缺失（egfr突变缺失）和12q扩增（包含mdm2和cdk4，通常用metex14扩增）。同样，我们没有在另一名t790m?患者中检测到原发性外显子19缺失/l858r突变（a058），表明失去激活egfr突变是获得性耐药真正罕见的机制。pik3ca突变（n=10，17%）和her2扩增（n=4，7%）是常见的，但基于t790m状态没有差异（分别为p=0.69和p=0.54），尽管耐药肿瘤中pik3ca改变的频率（17%）总体上高于晚期治疗未经egfr突变肿瘤的患者（5%，p=0.09）。在pik3ca突变中，值得注意的是，大多数是克隆的（n=5/7），并且由clinvar注释为可能致病的（n=6/7）综上所述，这表明pi3k信号在介导tki抵抗中的作用独立于t790m状态。鉴于keap1和nfe2l2共突变在产生治疗抵抗中的潜在作用。然而，我们没有在队列中检测到任何nfe2l2突变，我们只在t790m 肿瘤（a449）中检测到一个keap1突变。

    tp53改变是在大约一半的egfr突变的肿瘤中发现的早期克隆事件。与t790m 患者相比，t790m?患者tp53基因突变显著丰富(86%vs.50%，p=0.01)，其中大部分(n=36/37，97%)为早期克隆事件(n=36/37，97%)，与t790m 患者相比差异有显著性(p=0.01)。此外，mdm2和yeats4扩增在t790m 患者中更为常见，且与tp53突变互斥(p=0.004)。这两个基因位于同一染色体位置，负调控tp53。正如我们和其他人以前报道的，已知的癌症驱动基因突变的数量越多，多变量分析的ttp越短(hr，1.41；95%ci，1.09-1.81；p=0.008；补充图s8a)。特别是，并发的rb1/tp53改变(n=5)与t790m状态无关的ttp密切相关，与最近的一份报告一致。

    拷贝数分析发现，wgd是常见的，与治疗初期egfr突变肿瘤中观察到的比率(88%vs.89%)相当。然而，在7名(12%)没有wgd的患者中，所有人都是t790m (嵌入图像测试，p=0.04)，并且有egfr外显子19的缺失，这表明wgd的缺失预示着t790m 耐药疾病的出现。在t790m 和t790m?肿瘤之间，基因组不稳定指数(gii；中位数分别为52%和55%)没有差异，也没有发现tp53共突变与gii增加相关。t790m?患者的肿瘤突变负荷高于t790m 患者(tmb中位数为2.36vs.1.66个突变/mb，p=0.02，图1c；补充图1c、s9a)，可能是由于t790m?队列中的吸烟者数量较多

    接下来，我们检查了t790m?患者3q23(包含pik3cb、mras和foxl2等基因)和t790m 患者14q21(包含foxa1和nkx2-1)与t790m状态揭示扩增相关的反复焦点扩增和缺失事件(补充图s10)。值得注意的是，3qarm扩增在t790m?组(57%)高于t790m 组(13%)，并且是唯一有统计学意义的arm水平事件(图1e，embeddedimage-testp≤0.001)。我们证实了染色体3q基因(包括sox2)在3q臂增加的患者中有较高的表达(补充图s11c)。为了了解tki治疗后这些染色体水平改变可能获得的程度，我们再次与治疗前的队列进行了比较。在治疗-初始队列中，38例中有7例(18%)出现了3q增加(补充图s3)肿瘤。这一结果明显低于t790m?(p=0.003)，但与t790m 患者相似(p=0.53)，提示3q扩增可能是t790m?肿瘤特异获得的。有趣的是，染色体3q含有鳞状细胞系转录因子tp63和sox2，是肺鳞状细胞癌的主要特征，但以前与肺腺癌无关。

    接下来，我们研究了与egfrtki耐药相关的突变过程。在肺腺癌中发现了公认的突变特征，即衰老、apobec、dna双链断裂修复、吸烟和dna错配修复。与t790m?相比，egfrt790m耐药肿瘤对衰老信号的相对贡献率更高，这与egfrt790m点突变的三核苷酸背景下a[c>t]g的最高概率核苷酸变化一致(补充图3s12和s13)。相反，与t790m 肿瘤相比，非衰老特征(吸烟、载脂蛋白bec和dna修复)在t790m?中的比例显著高于t790m 肿瘤，暗示了驱动t790m?抗性的另一种突变过程。总体而言，这表明t790m耐药性可能不太可能出现在具有较大比例的活跃的非衰老突变特征(例如吸烟/apobec特征)的肿瘤中。

    我们使用wes数据估计了每个肿瘤样本的癌细胞比例(纯度)，并使用转录组去卷积方法tumera估计和比较了t790m 和t790m?肿瘤中癌症和间质(非恶性)细胞中的基因表达。值得注意的是，我们推测在t790m?肿瘤的癌细胞中，肺腺癌标志基因如napsa、nkx2-1、sfta2和sfta3的表达普遍且几乎完全丧失。此外，我们观察到鳞状细胞癌或神经内分泌癌的组织学标志基因在一小部分t790m?肿瘤中的表达增加(n=4，27%。这些发现得到了多重免疫荧光的正交验证，证实了与t790m 肿瘤相比，t790m?癌细胞中napsa和nkx2-1(ttf-1)的表达降低(图2d；补充图s14)。值得注意的是，对三个未接受治疗的nsclc腺癌队列的分析表明，低腺癌标志物基因(napsa和nkx2-1)的表达非常罕见，仅在egfr野生型肿瘤中观察到(图2f)。总而言之，这些数据突显了tki耐药后获得性谱系可塑性以前被低估的程度，特别是在t790m?肿瘤中，与3q扩增和非衰老突变签名过程共存，潜在地促进了表皮生长因子受体独立的信号机制。

    鉴于检查点抑制剂在egfr突变的nsclc中缺乏疗效，我们试图描述与egfrtki耐药相关的免疫环境，最初根据“t细胞炎症基因表达谱”(gep)特征对肿瘤进行分层。

    然后，我们使用了一种已发表的计算方法(teder；ref)进一步阐明与tki耐药相关的浸润免疫细胞亚群。这表明，与免疫t790m 肿瘤相比，免疫t790m?中mdscs的推测水平更高(p=0.04，t检验)，而tamm2的水平更低(p=0.003，t检验)。免疫t790m?中pd-l1、foxp3和ido的表达也显著高于免疫t790m 肿瘤(图3b，pd-l1和foxp3多重免疫荧光染色见附图s15b和s15c)。接下来，我们调查了耐药时的免疫表型是否与之前1g/2gtki的持续时间有关。有趣的是，免疫t790m?肿瘤的总ttp最短(图3c)，其中一半(5/10名患者)的总ttp小于3个月。相反，免疫t790m 肿瘤的总生存期最长(中位ttp20.6个月；范围8.2月至76.8月)，与免疫冷藏t790m 肿瘤相比(中位ttp4.1月；范围1.3月至13月；心率11.78；p=0.004；95%ci3.01月~46.2月；p=0.001；图3c)。meta分析强调单剂免疫检查点抑制剂在egfr突变的非小细胞肺癌(59例)、7/8(88%，4/8热、2/8冷、2/8未知)患者中缺乏疗效，这与meta分析一致(补充表s5)。然而，一名免疫t790m 患者(a096)在临床试验中接受了nivolumab-ipilimumab免疫检查点抑制剂的联合治疗(60例)，并获得了8.9个月的稳定病情。综上所述，我们的数据提示炎性趋化因子的潜在作用，例如，cxcl9-可能由mdscs驱动-在介导t790m?tki耐药中发挥作用。此外，我们的数据突出了gep“热”肿瘤中tme成分的显著异质性，说明需要更详细地询问免疫环境以描绘特定的免疫靶点。

    虽然第三代egfrtkis越来越多地被采用在一线环境中，但这种临床实践在一定程度上是由于无法预测单个患者的耐药轨迹。在确定了与不同egfrtki抵抗状态相关的新的分子特征(3q扩增、转录亚型、腺癌谱系标记丢失和炎症的tme)后，我们试图建立一个模型来预测t790m的出现。我们推测，这些基因组、染色体水平和转录特征可能存在于基线水平，也可能代表在治疗过程中获得的变化(图4a)。为了进一步探讨这一点，我们确定了在1g/2gtki治疗开始之前可能存在的三个躯干特征：egfr外显子19缺失、wgd缺失和tp53改变(图4a)。使用贝叶斯方法，单个患者可以根据他们治疗前的分子基因型被分成不同的组，其发生egfrt790m耐药的几率非常不同(图4b)。例如，在非wgd肿瘤中，发生t790m耐药性的概率在87.2%到97.9%之间，这可能意味着序贯治疗第一代/第二代到第三代egfrtki可能是这些患者(我们队列中11%的患者)可行的临床策略。这些特征的预测能力需要在更大的队列中进一步验证。然而，这些结果说明了数据驱动的治疗算法是如何通过真实世界的证据得出的，并可能有助于为个别患者定义最佳的排序策略。

    我们的研究首次对egfrtki耐药的基因组和转录图谱进行了全面和综合的分析。值得注意的是，我们的数据显示，到目前为止，血统的可塑性在一定程度上被低估了。尽管在tki耐药后有1%到3%的患者有组织转化的报道，但我们发现在t790m?肿瘤中，腺癌标志物(napsin-a和ttf-1)普遍丢失，同时非tru亚型(pi和pp)明显富集。虽然缺乏配对的基线样本是我们研究的局限性，但与治疗单纯的egfr突变的非小细胞肺癌的比较表明，腺癌谱系标志的丢失，特别是在t790m?疾病中，可能代表了慢性egfrtki暴露导致的早期去分化事件。t790m?疾病更显著的基因组改变有tp53突变(86%比50%)、3q扩增(57%比13%)和met改变(19%比3%)，这进一步导致了t790m?的可塑性和耐药性。

    临床上特别感兴趣的是t790m?队列中的免疫热亚群，它代表了一组患者的ttp明显较短，其特征是gep评分高，pd-l1过度表达，以及富含趋化因子的免疫抑制微环境。与我们的发现一致，回顾性分析表明pd-l1的高表达与低应答率和pfs之间的关系，提示“炎症性”tme介导对egfrtki的原发性耐药。最近，抑制egfr信号被发现可以耗竭treg和增加ifnγ信号，支持“炎性”的tme之间的联系，认为这是一种适应性变化，可能会削弱对靶向治疗的反应。我们的数据进一步表明，炎性的tme可能发生在原发或继发耐药时，并由cd8 t细胞(肿瘤抗原特异性和/或旁观者)、treg和mdsc可变地组成。最后，观察到ido1的高表达，特别是在t790m?免疫热肿瘤中，伴随犬尿氨酸的过度表达(kynu；图2b)，暗示ido途径在维持treg激活和在肿瘤亚群中的免疫抑制环境中起作用。最近，通过对一系列癌基因驱动的非小细胞肺癌肿瘤的单细胞rna-seq，maynard和他的同事同样强调了ido途径、免疫微环境和肺泡再生细胞特征在靶向治疗中的重要性。我们的数据扩展了这些观察，说明了治疗诱导的适应性细胞状态可能会受到基因组改变的影响，并表明癌细胞、免疫细胞群和趋化因子中egfr依赖性和谱系可塑性之间存在复杂的相互作用。为了更好地阐明这些免疫介质的作用，前瞻性研究正在进行中。免疫检查点抑制，包括联合抗pd-1和抗ctla-4治疗，在tki耐药环境下的临床试验中显示明显缺乏疗效。除了正在努力评估腺苷轴的免疫抑制靶点，如腺苷2a受体(a2ar)、cd39和cd73，未来临床试验的合理靶点可能包括ido、mdsc耗竭策略，如贝伐单抗或选择性抑制pi3k-γ。